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案例展示

核酸电泳

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  带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。是进行核酸研究的重要手段,是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶中进行,浓度不同的琼脂糖聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶,可用于分离不同分子量的核酸片段。

  凝胶电泳操作简便、快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心)所无法分离的核酸片段,是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。

  琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶,然后倒入去希胶模中,凝固后将形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。

  将凝胶置电场中,在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移,迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等想纸恋因素影响。在不同条件下电泳适当时间后,大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上,从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

  仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。

  电泳缓冲液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris,2.75g硼酸,2ml 0.5 mol/L EDTA,pH8.0)。

  溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,它可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在电泳过程中随核酸片段迁移,将凝胶置紫外光下,插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光,可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解,应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于 EB是一种强的诱变剂并有中度毒性,使用时必须戴手套操作。

  (1) 用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的塑料盘的边缘圈封,制成胶模,置水平工作台上;

  (3) 待溶液冷至60℃,加入10mg/ml EB贮存液,使终浓度达0.5mg/ml;

  (4) 在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳,将琼脂糖溶液倒入胶模中,厚度约3-5mm,注意避免产生气泡;

  (5) 凝胶完全凝固后,移去梳子和透明胶,将凝胶放入电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好没过胶面约1mm;

  (7) 接通电源,使样品槽在负极端,用1-5v/cm的电压,电泳适当时间;

  (8) 电泳结束后,可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察,并拍照记录,也可将不含EB的凝胶在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分钟,再如上观察和拍照,记录结果。

  需配置135照相机,全色135胶卷,照相机固定架,近摄镜和红色滤光镜以及。

  操作需在暗室进行,将相机固定好,把凝胶放在紫外检测仪上适当位置,调焦,装上红色滤光片,按常规拍照。

  由于EB具有一定的毒性,实验结束后,应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置,以避免背地海污染环境和危害人体健康。

  ②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ,混匀,再加入等量的25mol/L HCl,混匀,置室温数小时;

  聚丙烯酰胺凝胶通享只永过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链,长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶,其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度,调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例,可改变聚合物的交联度。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的,兼具分子筛和静电效应,分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。根据所要分离的核酸片段大小,可制备不同浓度的凝胶。

  由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应,灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下,仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触,从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。

  ① 30%丙烯酰胺:100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺。

  ② 5×TBE每升溶液含54g Tris.HCl,27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

  (2) 装置胶模将玻璃板和垫条事先用去污剂刷洗,并经自来水和无离子水冲洗干净,晾干。装置时,将较大的玻璃板平放在工作台上,将两个垫条放在玻璃板两侧,涂上少量凡士林,并将上层玻璃板置于垫条上,用夹子将玻板连同垫条夹紧,底部用1%琼脂糖密封。为防止漏胶,除放梳子一边外,其余三边应用防水胶带密封。

  (3) 根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量,按下表配制溶液(100ml)。

  将35μl TEMED加入100ml混合液中,混匀,然后均匀连续注入两玻璃板空隙中。

  (5) 室温聚合1小时,梳齿下出现折光带时,表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用,可用纱布或滤纸(用1×TBE浸泡)包盖于凝胶顶部,置4℃保存1-2天。

  (7) 除去底部胶带,将凝胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液,驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔;

  (8) 将核酸样品与适量6×凝胶加样缓冲液(见表2-28)混合,并加入凝胶加样孔中;

  (9) 接通电源,正极与下槽连接。电压一般控制在1.8v/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲,甚至引起小DNA片段的解链;

  (10) 电泳毕,取下玻板和凝胶,放在工作台上,从夹层一角轻撬,将上面的玻板轻轻移开,并小心揭下凝胶,置染色液中染色并进行结果观察。

  聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色,常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。

  (3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中,室温反应15-30分钟;

  (5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH,含1ml甲醛)中反应至条带显色清晰,本底适宜;

  琼脂糖凝胶电泳适合分离、纯化200bp-50kB长度的核酸片段,广泛应用于基因组提取与分析、载体构建、质粒提取等方面,分辨率较低,相差100bp以内的核酸片段较难分离。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kB以下的小核酸片段,适用于序列分析与比对、核酶分析与鉴定、小片段核酸的提取与分析等方面分辨率较高,可以精确分离相差十几至几十bp的小片段核酸分子。

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